Напоследък се провежда втори щурм срещу PCR диагностиката за COVID-19. Има няколко упорити мита, или по-скоро опорни точки, които безкритично се повтарят. Те са доста лесни за оборване, за човек който работи с PCR, интерпретира данни от PCR и в общи линии цялата PCR технология е част от ежедневието му, обяснява д-р Иван Димов.
Той разяснява някои от най-разпространените заблуди за PCR тестовете, както и какво всъщност представлява тази станала популярна по време на пандемията от COVID-19 диагностика.
1. Нали самите FDA се отрекоха от PCR тестовете?
Не, най-общо казано, просто CDC спират поддръжката на самоделния си PCR тест. Други такива продължават да се използват и да имат оторизация. На сайта на FDA може да намерите списък с одобрени тестове за COVID-19, сред които има десетки PCR тестове. Може сами да проверите от източника.
2. Откривателят на PCR, Кери Мълис, е казал, че не трябва да се използва за диагностика!
Любимо клише. Ако някой излезе с този гамбит, питайте какво точно е било възражението на Кери Мълис срещу PCR тестовете – засега получавам само цупене и помпозно игнориране на въпроса.
А иначе, починалият през лятото на 2019 г. Кери Мълис е известен случай на Нобелова болест – има редица непремерени изказвания, в разрез с експертния консенсус, по теми в които не е експерт (глобално затопляне, ХИВ). Ще се абстрахирам от това, и ще коментирам, без да се позовавам на репутацията му като аргумент. Това обаче важи в двете посоки – откривателят на дадена реакция, процес и технология не е учителят Тома Аквински, и не е последно-инстанционен авторитет по въпроса во веки веков. Неговите твърдения подлежат на обзор и критика, както на всеки друг учен.
Неговите възражения са не толкова срещу PCR, колкото необоснованото му отричане на връзката между ХИВ вируса и болеста СПИН. Отделно от това действително има и по-конкретни възражения към PCR тестовете – че тестът според него е качествен, а не количествен – т.е. можем да кажем има ли вирус или не, но не може да кажем какво точно количество вируси е имало в пробата (т.е. изчисленията за вирусен товар на база цикъл на позитивиране са неточни според Кери Мълис, не цялостната употеба на PCR за диагностика – самият той е консултирал за разработката на PCR тестове срещу ХИВ, въпреки възраженията си).
3. Тестът засича други тривиални вируси (има фалшиви положителни), за да ни затварят!
PCR тестовете имат относително по-висока чувствителност и специфичност сравнено с други категории тестове. Тази относително висока точност се дължи на взаимодействието на късия праймер с дългата ДНК верига – то е почти като ключ и ключалка – малки разлики в двете са достатъчни да предотвратят свързването им и от там първата стъпка на реакцията (за описание вижте въпрос 4). Фалшиво положителен тест може да се случи на практика единствено при лабораторна грешка или замърсяване. Фалшиво отрицателен тест може да има по по-разнообразни причини - пробовземането не е лесно, съхраняването и обработката на пробите може да бъде неидеална, вируса може да напуснал носоглътката и да е в долните дихателни пътища и пр.
В случая, РНК тестовете за COVID-19, търсят няколко сегмента от генома на вируса, кодиращи за различни протеини. Тези сегменти са специфични именно за COVID-19. Тях ги няма в генома на грипните вируси. Ако някой каже, че PCR теста бърка ковид с грип, помолете го да ви каже кой точно сегмент от генома води до припокриването. Геномите и на грипните вируси, и на ковид (които са доста различни), могат да бъдат намерени в интернет, така че това е лесно проверимо твърдение. Досега отново не ми е отговорен този въпрос, като съм го задавал на хора твърдящи че ковид открива грип. Същото се отнася за други тривиални инфекции – риновируси, аденовируси и пр. – те нямат генетичното сходство с ковид, за да позитивират теста.
Но, айде, нека речем че се лъже от тривиалните коронавируси, които причиняват настинка. Тук влиза ролята на секвенцията. Част от всички позитивни проби се секвенсират – разчита се целият им геном (това е цял отделен пост, има редица методи за това – Sanger sequencing, Illumina sequencing, Nanopore sequencing). От там идват данните за различните варианти, и тяхното разпространение. С други думи, ако имаше някакъв значим брой фалшиво позитивни тестове, предизвикани от тривиални коронавируси, това щеше да е очевидно в данните от секвенция.
Картината е леко различна при серологични тестове (разчитащи на антиген/антитяло взаимодействия). Те разчитат на взаимодействия между протеини а не нуклеинови киселини. Този тип взаимодействия са много по-неспицифични (както между ръка и ръкавица, а не ключ и ключалка), така че съществува теоретичната вероятност тривиален коронавирус да подведе такъв тест. Тя обаче е сравнително малка, тъй като тривиалните коронавируси са около 20% от настинките, болшинството са т.нар. риновируси.
4. Какво точно е PCR?
Ще дам възможно най-резюмираното обяснение, което същевременно да не спестява от важните детайли.
PCR или polymerase chain reaction – полимеразна верижна реакция – е химична реакция, катализирана от ензима ДНК полимераза. В тази реакция се взима денатурирана молекула ДНК, (т.е. обработена топлинно, така че двойната спирала е разплетена), къс сегмент ДНК, който се нарича праймер, който съответства (или на жаргон е “комплементарен“) на кратък сегмент от дългата денатурирана молекула, смес от нуклеотиди (градивните блокове на ДНК, подобни на мъниста в гердан) и ензима ДНК полимераза. При наличието на тези четири компонента, и подходящи условия ( pH, температура, концентрации), реакцията може да протече. В първата стъпка, краткият ДНК сегмент се свързва с дългата молекула, образувайки комплекс, в който има малък участък ДНК с двойна спирала, и дълга опашка от едноверижно ДНК.
ДНК полимеразата се захваща за мястото където започва тази “опашка“. От там, като конвейер, започва да наставя по-късия сегмент, прикрепяйки нуклеотиди съответстващи на тези в единичната верига (т.е. използва опашката като шаблон). По този начин началната ДНК молекула, с двоен и единичен сегмент, става двойна спирала по цялата си дължина. След последвала топлинна обработка, тази новополучена двойна спирала може да се денатурира, и процесът да се повтори циклично. Със завършването на всеки цикъл, количеството дълга ДНК се увеличава геометрично – като един вид молекулярен ксерокс.
Има много малко други химични реакции, които да имат такава индустриална и академична значимост, степен на оптимизация, приложимост и изследваност като PCR. Откритието е сравнимо с откриването на силициевите транзистори. Последните близо 40 години биотехнологичен прогрес биха били невъзможни без PCR.
5. Как обаче се прави такъв тест?
Ако използваме известен праймер (късия сегмент) може да установим неговото наличие или отсъствие в дадена проба с неизвестно ДНК. Този къс сегмент е например, може да е някаква част от генома на някакъв вирус или бактерия, който ни интересува.
Измервайки концентрацията на странични продукти от PCR реакцията, които действат като индикатор за нейното протичане. Т.е. ако знаем че PCR реакцията е протекла, то този сегмент е наличен в пробата.
6. Нали обаче коронавируса е РНК вирус, какво ни интересува ДНК проба?
При РНК проби се използва т.нар. RT-PCR, или reverse transcriptase PCR. При него има обработка на РНК пробата с ензим наречен обратна транскриптаза, който прави ДНК сегмент съотвестващ на РНК в пробата.
7. Какво означава Cycle threshold?
Както споменах, реакцията може да се извършва циклично, удвоявайки количеството дълго ДНК, и измерими странични продукти. Когато тези продукти минат определена стойност, теста се счита за позитивен. Ако обаче оставим теста да се повтаря до безкрай, той ще излезе положителен заради наличието на други странични реакции. За това има лимит от повторения, преди да се обяви за отрицателен – обичайно около 30-40, което зависи от производителя на конкретния тест, лаборатория, относителния риск между фалшиво позитивен и фалшиво отрицателен и т.н. Позитивните тестове обичайно изскачат след около 20-ина цикъла
Справка: Distribution of SARS-CoV-2 PCR Cycle Threshold Values Provide Practical Insight Into Overall and Target-Specific Sensitivity Among Symptomatic Patients
Blake W Buchan, Jessica S Hoff, Cameron G Gmehlin, Adriana Perez, Matthew L Faron, L Silvia Munoz-Price, Nathan A Ledeboer
Am J Clin Pathol. 2020 Jul 20 : aqaa133. Published online 2020 Jul 20. doi: 10.1093/ajcp/aqaa133
PMCID: PMC7454307
Още по темата
Медицина
Не, PCR тестовете не са прекратени, защото не различавали COVID-19 от грип
Животът
Д-р Димов отговаря на някои от най-често срещащите се опасения спрямо ваксините
Животът
Още доказателства подкрепят нееднозначното твърдение, че гените на SARS-CoV-2 могат да се интегрират в човешката ДНК
Коментари
Моля, регистрирайте се от TУК!
Ако вече имате регистрация, натиснете ТУК!
2017
1
23.10 2021 в 00:32
Последни коментари