Групата на Нобеловата лауреатка Дженифър Дудна генно-инженерира ензима Cas-9. Модифицираният ензим iCRISPR-Cas9 успява по-бързо да разгъва ДНК, а това значително ускорява редактиранията на генома.(Eggers et al., 2024, Cell 187, 3249–3261 https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.031
Кредит: Cell, Dudna
iGeoCas9 улеснява образуването на бримката “R-loop” в условия на ниска клетъчна концентрация на магнезий. Това е осъществено чрез три насочени мутации в WED домена на CRISPR-Cas (означени със звездички). Те помагат на WED домена в разплитането на прицелната ДНK като се вклинява (WED е съкращение от wedge - клин) в областта PAM( protospacer adjacent motif). Това е къса ДНК последователност, която влияе на образуването на бримката R-loop - тя става по-голяма под действието на модифицирания ензим iGeoCas9 (виж дясната половина на горната схема) в сравнение с дивия тип (лявата страна). Вследствие на това редактирането на ДНК чрез този iCRISPR-CAS ензим е много по ефективно. В червено е отбелязана sgRNA (single guide RNA) - водещата РНК, която разпознава едната верига на разгънатата прицелна (target) ДНК.
Термостабилните клъстери от равномерно разположени къси палиндромни повтори (CRISPR) и свързаните с тях CRISPR ензими Geobacillus stearothermophilus Cas9 (GeoCas9 могат да подобрят ефективността на редактиране на генома поради удължения живот на протеините. Първоначалните експерименти обаче показват, че ензимът GeoCas9 е практически неактивен, когато се използва в култивирани човешки клетки. Чрез лабораторна еволюция варианти на GeoCas9 преодоляват този недостатък чрез мутации в клиновидния (WED) домен, и довеждат до >100 пъти по-високи нива на редактиране на генома. Структурите от криоелектронна микроскопия (крио-ЕМ) на дивия тип и подобрените ензими GeoCas9 - iGeoCas9 - разкриват разширени контакти между WED домена на iGeoCas9 и ДНК субстратите. Биохимичният анализ показва, че iGeoCas9 ускорява размотаването на прицелните ДНК субстрати въпреки ниската концентрация на магнезий при клетките на бозайниците (за разлика от бактериалните клетки). Резултати разкриват нова роля на WED домейна на ензима Cas9 в размотаването на ДНК-мишената, а това силно подобрява активността на Cas9 при редактиране на генома.
Допълнение :Това, че образуването на R-loop бримката в ДНК определя скоростта на скъсване на прицелната ДНК се знае от 2018г. (Gong et al., 2018, Cell Reports 22, 359–371 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.12.041 ):
Кредит: Cell reports
HNH и RuvC(означени със зелени кръгчета) са два домейна(области) на ензима Cas9 които скъсват веригите на подлежащата на редактиране ДНК.HNH е нуклеазния домейн на ензима Cas, който скъсва комплементарната верига на прицелната ДНК, докато RuvC домейна скъсва некомплементарната верига на ДНК, която не е на прицел.
Подобряването на функцията на редактора Cas9 e нагледен пример как човешкият гений, чрез изкуствено насочена еволюция (с мутации) може да подобри това, което природата му е предложила с Crispr-Cas9.
Програмируеми ензими за мащабно редактиране на ДНК
Откриването на рекомбинази насочвани от РНК към специфични “донорни” последователности на ДНК за да ги “заведат” към специфични “прицелни” места от ДНК, отваря нова глава в редактирането на генома - позволява вмъкване, обръщане, изтриване (инсерции, инверсии и делеции) на дълги ДНК последователности в подбрани геномни позиции.
Техниката, описана в три статии, публикувани този месец в Nature (статии 1,2) и Nature Communications(статия 3), използва естествената способност на мобилните генетични последователности IS, наречени скачащи гени, да се вмъкват(като донори) на определени места (прицели) в геномите.
Кредит: Visual Science. Две бримки в РНК правят мост между донорната и прицелната ДНК и улесняват специфичната рекомбинация на ДНК/Chemical & Engineering News Max Barnhart June 26, 2024 | Volume 102,
Учените Patrick Hsu, Nick Perry и Matt Durrant,от Arc Института в Пало Алто са водещи автори в откритието. .Кредит Ray Rudolph
Ръководени от РНК молекула, наречена „мостова“ РНК (bridge RNA) или „seekRNA“, бактериите могат да редактира генома си. Все още не е ясно дали може да бъде адаптирано това за работа в човешки клетки. Ако това стане, методиката може да се окаже революционна поради малкия си размер и способността да прави генетични промени с дължина хиляди бази и без да нарушава веригата на ДНК, Промените в ДНК могатда са много по-големи, отколкото е практично при редактиране на генома с CRISPR-Cas9.
Откриването на рекомбинази, които използват лесно приспособими РНК молекули за разпознаване на ДНК цели, би могло да премахне ключовите предизвикателства на съществуващия инструментариум (CRISPR и iRNA- пост-транскрипционно заглушаване на специфични гени) , точно както препрограмируемите водещи РНК на ДНК-разрязващите ензими CRISPR-Cas поставиха началото на нова ера в редактирането на генома преди 15-тина години.
Откъде идват тези “генетични редактори”: Това са ДНК последователностите, които се движат в генома, известни като подвижни генетични елементи (IS). (IS110, IS111)) са едни от най-простите и компактни мобилни генетични елементи. Те носят информация, кодираща производство на рекомбинази, както и на две РНК , съответно в левия и десния край на мобилния елемент. Протеините, кодирани от IS от семейството IS200/605 - са предшественици(прародители) съответно на ензимите Cas9 и Cas127, и също са ензими за разкъсване на ДНК (нуклеази), които използват водеща РНК, за да ги насочат към специфични ДНК последователности (прицелни). Освен това ензимът транспозаза TnpA, който често се експресира съвместно с TnpB, се използва за програмируемо редактиране на генома. Като се има предвид, че програмируемостта чрез РНК е в основата на разнообразните функции на ензимите, кодирани от IS, изглежда възможно рекомбиназите да са еволюирали, за да използват РНК по подобен начин. Предполага се, че некодиращите краища на повторите от семейството IS110 и IS111 помагат за регулиране на експресията и активността на кодираната рекомбиназа.
Текст към фигурата (от допълнителната информация -от C. J. Tou & B. P. Kleinstiver )| Сравнение на конвенционалните и “мостовите” рекомбиназни ензими. Рекомбиназните протеини катализират реакции, при които дълги участъци от ДНК се изрязват от донорната ДНК (в бледосиньо) и се вмъкват в целевата ДНК(в червено).
а, Конвенционалните рекомбинази разпознават ДНК последователности, като образуват обширни взаимодействия между протеини и ДНК. При реакциите на вмъкване (insertion) четири молекули рекомбиназа се свързват специфично с последователността, която ще бъде изрязана от донора, и с целевата (прицелната) последователност, в която ще бъде вмъкната ДНК на донора. Този начин на разпознаване (между белтък и ДНК) на последователностите, обаче, е сложен, което затруднява конструирането на протеини, които да се свързват специфично с други ДНК последователности. По-удобно и точно е разпознаването между ДНК и РНК.
б, В статиите 1-3 в списанието Нейчър се съобщава за рекомбинази, които използват молекула РНК (наречена “мостова” РНК (bridge RNA) или “търсеща” РНК (seek RNA) за разпознаване на специфични ДНК последователности. Тези РНК съдържат две бримки (loops) оцветени в жълто и синьо), които се свързват разпознавайки донорните и целевите последователности, както е показано на схемата. Примките (клуповете; loops) могат да бъдат независимо конструирани, така че рекомбиназата да извършва инверсии, делеции и инсерции поа зададени от потребителя последователности.
Credit: Arc Institute
CRISPR изисква поправка на клетъчната ДНК след извършване на специфичния разрез, докато "мостовото рекомбиназно редактиране" може да извършва ДНК рекомбинация, без да изисква клетъчни механизми за ДНК репарация. Това потенциално може да доведе до по-безопасни резултати при редактирането на гени, тъй като CRISPR разрезите могат да причинят големи делеции или нежелани транслокации на мястото на разреза.
Рекомбиназните ензими се насочват към 30-50 нуклеотида на донорната ДНК за да ги интегрират в прицелните (target) последователности. Скачащите ДНК повтори са се разпространявали из бактериалния геном и са спомогнали на неговата еволюция. Те кодират рекомбиназа и от двете страни носят информация за две РНК, част от които образуват бримки( loops). Едната бримка се свързва с донора, другата - с прицела. Мостовите РНКи могат да се подбират съобразно с нуждите от специфично ДНК редактиране.
Удивително е как природата е достигнала до този механизъм за промени в генома. Подвижните елементи IS носят всичко, което им трябва - кодиращите рекомбиназата ДНК последователности, а наоколо отляво и отдясно на краищата са ДНК последователности, които след транскрипция произвеждат мостовите РНК, които повеждат рекомбиназата към точните места на двете ДНК (донор и таргет).
И кой знае колко още подобни тайни, заложени в геномите от милиони години, чакат да бъдат разкрити в бъдеще.
Справка:
Статия 1.Bridge RNAs direct programmable recombination of target and donor DNA, Matthew G. Durrant, Nicholas T. Perry, James J. Pai, Aditya R. Jangid, Januka S. Athukoralage, Masahiro Hiraizumi, John P. McSpedon, April Pawluk, Hiroshi Nishimasu, Silvana Konermann, Patrick D. Hsu,
Nature 2024, 630, 984–993.https://doi.org/10.1038/s41586-024-07552-4
Статия 2.Structural mechanism of bridge RNA-guided recombination,
Masahiro Hiraizumi, Nicholas T. Perry, Matthew G. Durrant, et al. Nature 2024, 630, 994–1002. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07570-2
Статия 3.de la Gándara, Á., Spínola-Amilibia, M., Araújo-Bazán, L. et al. Molecular basis for transposase activation by a dedicated AAA+ ATPase. Nature 630, 1003–1011 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07550-6
Допълнителна информация: C. J. Tou & B. P. Kleinstiver : https://www.nature.com/articles/d41586-024-01461-2 Programmable RNA-guided enzymes for next-generation genome editing (nature.com)
Вж, за CRISPR https://nauka.offnews.bg/zhivotat/genetichnata-nozhitca-crispr-cas9-metodat-za-promiana-na-koda-na-zhi-157786.html
Вж, за рекомбинация на ДНК: д-р Майя Маркова: http://www.mayamarkov.com/biology/16Recombin2/16Recombin2.htm
По материали в научния печат обобщил: д-р К. К. Чипев, Стони Брук-ски университет, Ню-Йорк
Коментари
Моля, регистрирайте се от TУК!
Ако вече имате регистрация, натиснете ТУК!
Няма коментари към тази новина !
Последни коментари