Когато бе открит преди десетина години, ДНК-редактиращият ензим CRISPR предизвика революция в генното инженерство и доведе до Нобелова награда за учените.
Ако епигеномно редактиране с помощта на метода CRISPR може да програмира транскрипционната памет през много клетъчни деления и диференцияция, то епигеномът подобно на генома ще се унаследява. Това бе демострирано в една нова статия на Нунец и сътр. в списанието Cell от април 2021, описваща метод CRISPRoff, който действа по целия геном, чрез редактиране без промяна на последователността на ДНК.
Живеем в епохата на епигеномното инженерство
Скоро след въвеждането на метода CRISPR той се прилага в лабораториите на Джонатан Вайсман и Дженифер Дудна (бъдещата Нобелова лауреатка) за специфична репресия или активиране на конкретни гени в прокариотни и еукариотни клетки. Използува се CRISPR ензим с дезактивирана нуклеазна активност – dCas9. Към него могат да се закачват други активни белтъчни компоненти, известни с репресорните или активиращите си качества.
За прицелване на генната активност към конкретни участъци на генома CRISPR-комплексите използват къси водещи РНК (guide RNA -gRNA, дълги 20тина нуклеотида), с които търсят съответствие с ДНК по продължение на генома. Ензимът Cas9( виолетовият овал) разплита двойната спирала и сравнява и търси съвпадение с водещата РНК – gRNA. В оригиналния CRISPR CAS9 срязва двете вериги на ДНК в намерения участък:
Кредит: https://www.pnabio.com/
Ако се добавят няколко вида такива водещи РНК с тях може да се влияе на активността на няколко гена едновременно. Тази модификация се нарича мултиплексен CRISPR-Cas.
 |
|
Фиг 1. Схема на мултиплекс-CRISPR технологията С едновременната експресия на няколко водещи РНК – gRNA (показани в долната част на фигурата, CRISPR-(жълти елипси) може да влияе на генната активност на поредица от гени в една клетка като Редактирането предполага скъсване на двуверижната ДНК, което се поправя с клетъчните ДНК-репариращи ензими. Регулация на транскрипцията се осъщестява чрез насочване на инактивиран ензим Cas9 насочен с водещите РНК към ДНК-области преди или след началото на транскрипция, където или пречи на работата на РНК-полимеразата, или привлича транскрипционни фактори (чрез ковалентно свързани към Cas ефекторни белтъчни фрагменти - зелените и оранжеви цилиндри на фиг.1), които действат стимулиращо или репресиращо върху целевия ген. Фиг. по McCarty, N.S., Graham, A.E., Studená, L. et al. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nat Commun 11, 1281 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-15053-x |
Използуването на дезактивиран ензим CRISPR – dCAS9 модифицира техниката CRISPR от геномно в епигеномно редактиране.
В статията на Нунец и съавт. се описва начин за епигеномна редакция по продължение на целия геном като се установи обратимо транскрипционна тишина, която поколенията помнят след поредните клетъчни деления.
Терминът „Епигеномна редакция“ подчертава, че не се мени генетичния код, а само начина, по който той се чете и интерпетира. За репресия се използува закачване на метилна групи към нуклеотидите. Известно е, че това метилиране се запазва при репликация на ДНК. Родителските вериги, носещи метилираните нуклетиди инструктират метилирането и на новосинтезираните дъщерни вериги в същите области от ДНК.
Доскоро се смяташе, че само специфични последователности от ДНК съдържащи CpG (цитозин/гуанин) могат да бъдат метилирани. Ако се метилира ДНК това помага за потискане на генната активност в метилираните места. Но с новия комплекс CRISPRoff разработен от Нунец и съавт. в лабораториитe на Джонатан Вайсман и Люк Джилбърт, от Университета на Калифорния и Уайтхед Института в Масачузетс, метилирането може да се разпростира по целия геном и така значително се потушава генната експресия не само в CpG областите. Това става без да се променя самия генетичен код.
Досега епигенетичното редактиране предполагаше постоянно производство на изкуствените белтъци регулиращи генната експресия, които не се унаследяват при клетъчните деления. С новия подход е достатъчно само временно производство..
Епигеномното редактиране е напълно обратимо с помощта на паралелно конструирания от същата група учени комплекс – CRISPRon, който премахва/изтрива метиловите маркери от ДНК.
 |
|
(Фиг. 2 е от Moussa HF... Cell, Volume 184, 29 April 2021, Pages 2281-2283) CRISPRoff: Програмируемият записвач на епигеномна памет се състои от един каталитично неактивен CRISPR белтък - dCAS9, който може да установи ултра-стабилно и унаследяемо заглушаване на гените. (А) Нунец и съавт.(2021) конструират многобелтъчен комплекс CRISPRoff, в който dCas9 е свързан ковалентно с ефекторните области на белтъците KRAB (той помага на хистон- модифициращите фактори), Dnmt3A и Dnmt3L (ДНК-метилиращи ензими). Временната експресия на съставния белтък CRISPRoff предизвиква специфично метилиране на хистона (H3K9) и на нуклеотидите на ДНК, и с това довежда до много стабилно заглушаване на гените в продължение на повече от 450 клетъчни деления и в 80-90% от клетъчната популация. Заглушаването чрез CRISPRoff е обратимо чрез експресия на съставния белтък CRISPRon – изтривач на епигеномната памет: към dCas9 са прикачени няколко активни белтъка - ДНК деметилазата TET1 (която премахва метилните групи „записани“ преди това от CRISPRfoff) и различни транскрипционни активатори (VP64, p65, Rta). Така освен изтриване на „метилното“ заглушаване се рeактивира транскрипцията върху участъците, в които комплексът е „прицелен“ от водещите РНК (guide gRNA). Кратковременно прилагане на CRISPRon e достатъчно за да се изтрие репресиращото метилиране. Така че CRISPRoff/CRISPRon системата е специфичен епигенен превключвател на генната експресия. Тези свързани помежду си транскрипционни активатори - VP64, p65, Rta (означени с трите триъгълничета в горната част на фиг.1(А)) могат да се доставят и без да са ковалентно свързани с dCas9. Вместо това към тях ковалентно е свързaн белтъка MS2CP (известен с това че участва в обвивката на бактериофага MS2). Белтъкът MS2CP взаимодейства специфично с водещата РНК, към която е добавена една РНК-последователност MS2 (намерете малката бримkа-фибичка на gRNA, стърчаща извън dCAS9 комплекса. Tя осигурява специфично РНК-белтъчно взаимодействие - вж. полумесечинката, която е свързана с триъгълничетата на фиг.1А вдясно горе). Така, воден от gRNA, MCP e прицелен от dCas9 до точното място в генома , например близо до транскриопционно начало, а с МS2CP там отиват и закачените към него активиращи компоненти VP64, p65, Rta. (B) Записаното от CRISPRoff специфично генно заглушаване е стабилно и оцелява при клетъчна дифенцияция на индуцирани плурипотентни клетки (iPSCs) в неврони. Епигенетичната репресия(заглушаване) се запазва в диференцираните неврони и пречи на работата на един ген, свързан с неврологично заболяване. (C) Предимства на CRISPRoff технологията: |
Терапевтичният потенциал на CRISPRoff
При все че генната и клетъчна терапия са бъдещето на медицината към тях има потенциална резервираност, тьй като тези методи включват перманентна промяна на генома. Затова ние се опитваме да намерим други пътища, използувайки CRISPR, за да третираме болестите – казва Люк Джилбърт, един от главните съавтори на статията.
Ако прицелът за метилиране е само гена MAPT, който кодира белтъка Tau, свързан с болестта на Алцхаймер, CRISPoff намалява с 90% експресията му. Когато това се направи в стволови клетки, след химичната им трансформация в неврони генът продължава да е потиснат. Така се показва, че има епигенно унаследяване, като нов вид клетъчна памет. Подчертавайки терапевтичните възможности на този подход, проф. Вайсман предупреждава, че прилагането му ин виво няма да е лесно. Как да се осъществи доставката на CRISPRoff в един възрастен организъм и ще бъде ли достатъчно да се повлияе на заболяването на Алцхаймер?
Епигенетичните редактори като CRISPRoff имат голям терапевтичен потенциал, най-вече защото запаметяват епигеномно информацита не само в третираните клетки, но и след 450 клетъчни деления. Изненадващо е, че даже в стволови клетки, които преминават през многократни репрограмирания на епигенома, метилираните от CRISPRoff места се запазват в значителна част от клетките. Тези находки показват, че дългоживущ терапевтичен ефект се получава след еднократно прилагане на CRISPRoff, което е много обнадеждаващо при третиране на редки генетични дефекти – като синдрома Марфан, засягащ съединителната тъкан, Job синдрома (дефект на имунната система) и някои форми на рак, свързани с активността на едно повредено копие на гена.
Методът CRISPRoff предлага ефективна, специфична възможност за манипулация на епигеномната памет. Той позволява много научни и терапевтични приложения във всякакви видове животински клетки .
Източник: https://www.bionews.org.uk/page_155920 и в
Оригиналната статия: “Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing” by James K. Nuñez, …..Luke A. Gilbert and Jonathan S. Weissman, 9 April 2021, Cell. DOI: 10.1016/j.cell.2021.03.025
Резюмирана в Moussa HF... Cell, ,Volume 184, 29 April 2021, Pages 2281-2283 “Here to stay: Writing lasting epigenetic memories” doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.007
Популярно обяснение - 14 мин видеоклип:
Авторът Константин Чипев е молекулярен и клетъчен биолог от Университета Стони Брук в Ню Йорк.
Още по темата
Животът
Мистерията около близнаците
Животът
Учени разработиха нова стратегия за генна терапия за забавяне на стареенето
Животът
Нов тест за COVID-19, базиран на CRISPR, използва камера на смартфон
Коментари
Моля, регистрирайте се от TУК!
Ако вече имате регистрация, натиснете ТУК!
Няма коментари към тази новина !
Последни коментари