Промени в ДНК-режещия ензим Cas9 правят CRISPR метода за генно редактиране много по-прецизен.
Кейт Джунг помни първия път, когато пробвал метода CRISPR. В края на 2012 г., патологът от Massachusetts General Hospital в Бостън сглобил компонентите на новата технология за генно редактиране и си поиграл с ДНК-то на ембрион на рибата зебра (zebrafish - стандартен експериментален обект). "Беше толкова лесно," споделя той. "Направо изумително."
CRISPR методът - състоящ се от високоефективен набор от молекулярни "ножици", който наскоро бе отличен като Научен пробив на 2015 година - може да е лесен за употреба, но съвсем не е перфектен. Джунг и колегите му скоро установили, че тези "ножици" могат да режат повече от необходимото, прерязвайки ДНК на неочаквани и нежелани места. При ранните експеримент, учените открили, че тези странични ефекти могат да възникнат на някои места в ДНК с приблизително същата честота, както и на целевите участъци. Това е сериозен проблем, ако възнамеряваме да превърнем CRISPR в основа за бъдещи терепии при хора, например поправянето на дефектни гени, които причиняват мускулна дистрофия или наследствено заболяване на черния дроб. Основното притеснение на учените е, че прерязването на нежелан ген може да предизвика неконтролируем растеж и рак.
Сега, Джунг и колегите му са открили начин да направят CRISPR по-прецизен. При най-новото си изследване, те са модифицирали режещия ензим, за да понижат страничните ефекти на практика под нивото на детекция.
"Смятам, че има вероятност това да е сериозен пробив," смята Джин-Со Ким (Jin-Soo Kim), молекулярен биолог към Националния Университет в Сеул, който не е участвал в изследването. Но стремежът за подобряване на CRISPR едва ли ще приключи тук. "Няма медикаменти без странични ефекти," отбелязва той. Базираните на CRISPR терапии все още са далеч от тестване върху хора и никой не знае каква реална прецизност ще е необходима.
CRISPR разчита на ДНК-режещ ензим наречен Cas9, прикачен към къса РНК последователност, която го насочва към специфичен участък от генома. Когато РНК-то намери комплементарна - или почти комплементарна - последователност, Cas9 извършва прерязване на нуклеотидната верига. Вече има няколко подхода за предотвратяване на нежеланото прерязване. Скъсяването на дължината на водещата РНК я прави по-чувствителна на несъответствия, но също така може да доведе до разпознаване на нови странични мишени. Някои лаборатории са експериментирали с версия на Cas9, която прерязва само едната верига на ДНК вместо и двете. Това означава, че е небходимо два Cas9 ензима носещи различни насочващи РНК-и да разпознаят съответната си целева последователност, за да се прережат и двете вериги - така процесът на съвпадение на последователностите е доста по-стриктен. Но удвояването на броя на водещите РНК-и създава известни ограничения, които могат да затруднят доставянето на CRISPR-базирани терапии в клетките.
В новото изследване, публикувано тези дни в Nature, Джунг и колегите му са изпробвали друг подход. Те са модифицирали ензима Cas9, за да променят начина, по който той взаимодейства с ДНК. Първо, те променили някои аминокиселинни остатъци по повърхността на ензима, от които се очаква да подпомагат за свързването на водещата РНК със съответстващата й верига в ДНК. Част от модификациите създали нов вариант на Cas9, означаван като Cas9-HF1, който демонстрира по-голяма точност при прерязванията, които извършва. Учените направили 7 различни модифицирани варианта, водени от 7 различни РНК вериги, за всяка от които било известно, че генерира странични ефекти с обикновения Cas9. Учените докладват, че Cas9-HF1 не показал детектируеми странични ефекти в шест от тези случаи - и само няколко странични прерязвания при седмия тестван ензим. Джунг добавя, че наблюдаваните погрешни срязвания при последния може да се дължат на грешка в самата секвенция.
Подобни резултати бяха получени и от един от пионерите в CRISPR генното редактиране, Фенг Цианг (Feng Zhang) от Харвардския университет и Broad Institute в Кембридж, щата Масачузетц, публикувани миналия месец в Science. Този екип учени модифицирали Cas9, за да променят начина, по който той контактува с различните части на ДНК в клетката. Този метод също значително подобрил специфичността на CRISPR. Все пак е трудно да сравняваме тези резултати директно с тези в новото изследване, тъй като учените са използвали различни методи за измерване на страничните прерязвания.
Джунг твърди, че измерванията на неговата група са около 10 пъти по-чувствителни от тези използвани при изследването в Science. И двете изследвания разчитат на методи, които прикачат молекулни маркери на всички места в генома, където се е осъществило двойноверижно срязване, преди да секвенират късите маркирани сегменти, за да преброят срязванията в различните гени. Джунг и колегите му твърдят, че могат да засекат срязвания, които се осъществяват в поне 0,1% от генома. Цианг пък отбелязва, че методът в неговото изследване е с потвърдена ефективност до 0,3%, но той може да е дори още по-чвуствителен.
Дали детектирането на само няколко погрешни срязвания на 1000 има значение? Абсолютно, смята Джунг. "Много терапевтични стратегии предвиждат потенциалното манипулирането на милиони, десетки милиони и дори стотици милиони клетки. Затова 1 на 1000 звучи доста добре, но тази стойност все пак може да се окаже прекалено висока." Той смята, че има нужда от разработване на по-добри тестове, за да се сведат тези потенциални нежелани ефекти до честота от 0,01% и дори по-малко.
Други са по-малко загрижени за повишаването на чувствителността на тестовете. Тъй като CRISPR никога няма да достигне ниво на никакви странични ефекти, ключовият въпрос за дадена терапия не е точно колко нежелани прерязвания ще има, а дали това нарушава функциите на жизненоважни гени, смята Джийнг-Куан Йе (Jiing-Kuan Yee), молекулярен биолог от изследователския център City of Hope в Дуарте, щата Калифорния. Всяко терапевтично приложение ще изисква свои собствени внимателно селектирани Cas9 молекули - и модификации като тези докладвани в тези две изследвания може да се комбинират.
"Смятам, че съвсем скоро всички ще започнат да използват тези модифицирани Cas9 ензими," твърди той. "Проблемът със погрешните прерязвания все още остава, но ефектите му ще бъдат значително по-ограничени."
Източник: Science Magazine
Коментари
Моля, регистрирайте се от TУК!
Ако вече имате регистрация, натиснете ТУК!
Няма коментари към тази новина !
Последни коментари