Нов подход използва ензима транспозаза, мобилизиращ ДНК, свързан с генния редактор CRISPR, за извършване на целеви редакции с размер на цял ген. Това е значителна стъпка към лечението на генетични заболявания.
Естественият интелект (и стоящата зад това Природа) на първите клетки - бактерии и архебактерии e изработил свой имунен механизъм срещу всякакви прииждащи чужди ДНК под формата на фаги, плазмиди, вируси и др.
С откриването (2012 г.) на този клетъчен подход, наречен CRISPR, се даде огромен тласък в редактирането на гените.
Напоследък бе разкрито, че природният интелект мобилизира специфично своята ДНК и използва ДНК ензима транспозаза, за да скача из генома (тези скачащи сегменти на ДНК, които са важни при еволюцията на тази знаменита молекула, се наричат транспозони).
Ако CRISPR редакторът вмъква или делетира участъци от ДНК, в комбинация с транспозазата, той може да действа с много по-големи парчета ДНК.
Това веднага бе взето на въоръжение, за да се приложи в генната терапия. Способността да се инсталират големи ДНК последователности в определени места в човешкия геном има широкообхватни последици, включително проправяне на пътя за лечение с едно лекарство на мутационно различни генетични заболявания, при които има загуба на функция.
Свързаните с CRISPR транспозази (CASTs) са естествено срещащи се системи, които поддържат РНК-програмируемо вмъкване на ДНК с размер на ген, но са показали минимална активност в човешки клетки.
В новаторско откритие в областта на генната терапия, изследователи са представили генния редактор evoCAST - иновативен инструмент, предназначен да подобри прецизността и ефективността на генното редактиране. Тази революционна система обещава да преодолее значително предизвикателство в генетичната медицина: способността за точно вмъкване на дълги ДНК последователности в специфични места в човешкия геном, без да се предизвикват нежелани мутации. Този скок би могъл да проправи пътя за по-надеждни и всеобхватни лечения на генетични заболявания. Кредит: George Lampe (Columbia University Irving Medical Center)
Способността да се инсталират големи ДНК последователности в определени места в човешкия геном има широкообхватни последици, включително проправяне на пътя за лечение с едно лекарство на мутационно различни генетични заболявания водещи до загуба на функция.
Свързаните с CRISPR транспозази (CASTs) са срещащи се в природата системи, които поддържат РНК-насочено вмъкване на ДНК с размер на ген, но са показали минимална активност в човешки клетки. Айзък Уайт (Isaac Witte) и колегите му са разработили платформа за подобряване на CAST активността чрез еволюция на CAST с повече от 200 пъти повишена активност в човешките клетки. Този ензим позволява ефективна генна интеграция в различни терапевтично важни геномни места в множество типове човешки клетки.
Въпреки че настоящите методи за редактиране на гени могат да коригират повечето мутации, причиняващи заболяване, генетичното разнообразие, лежащо в основата на много разстройства, ще изисква проектиране и редакция на специфични различни мутациите. Това значително ограничава броя на пациентите, които могат да се възползват от терапевтичното редактиране на генома. Програмираната геномна интеграция на здраво генно копие може да предложи лечение за генетични заболявания със загуба на функция, което не зависи от конкретните мутации, тоест, то е “мутационно-агностично”. Освен това такава насочена генна интеграция позволява други приложения, включително имунотерапии на рак.
Свързаните с CRISPR транспозази (CASTs) са естествено срещащи се бактериални системи, които използват редактора CRISPR без нуклеазната му активност, и интегрират ДНК в геномни местоположения, определени от насочваща РНК.
CASTs предлагат много атрактивни качества като инструмент за редактиране на геном, включително лесна програмируемост, съвместимост с многокилобазов мащаб на ДНК, която ще се вмъква/интегрира, с избягване на геномни двойноверижни ДНК прекъсвания.
Въпреки тези свойства, CAST от див тип, известни досега, водят до минимална интеграция в човешки клетки (често ≤0,1% от третираните клетки). За да постигнат по-ефективно интегриране на CAST в човешките клетки, авторите разработват метод с помощта на фаги (PACE подпомагана от фаги постоянна еволюция) - система за непрекъсната еволюция, която бързо развива CAST варианти, способни на бързо целево “транспозиране” - РАСЕ (Phage-Assisted Continuous Evolution).
Използвана е съществуващата в природата бактерия Pseudoalteromonus, в която има транспозони тип Tn7 свързани с CRISPR - CAST. Като се приложи CAST-PACE за еволюция на прототипа CAST се прдизвиква усъвършенстването на CRISPR транспозазата CAST.
Интегрирането на целева ДНК в E. coli се свързва с размножаването на непрекъснато мутиращи фагови геноми, които кодират развиващи се компоненти на CAST. След стотици поколения непрекъсната селекция, репликация и мутация, при които полученият фаг оцелява общо 10322-кратно разреждане, се генерира еволюирал вариант на CAST и транспозазния му белтъчен компонент протеин TnsB, който медиира повече от 200-кратно подобрена интеграционна активност в човешки клетки.
Еволюиралият TnsB съдържа 10 усилващи активността мутации, разположени по целия протеин, които вероятно модулират няколко различни взаимодействия с други CAST компоненти. Трябва да се отбележи, че еволюиралият TnsB води до ефективна интеграционна активност в човешки клетки, без да се изисква добавка на бактериалния CAST спомагателен протеин, ClpX, който е цитотоксичен.
Този еволюирал TnsB с други еволюирали чрез PACE и рационално проектирани CAST компоненти, за да се образува evoCAST, система, оптимизирана за дейност по интегриране в човешки клетки. EvoCAST постигна 10 до 30% ефективност на интеграция в 14 геномни мишени в човешките клетки, което представлява 420-кратно средно подобрение спрямо CAST от див тип.
EvoCAST може да понесе големи ДНК товари >10 kb и посредничи при интегрирането на няколко терапевтични полезни интеграции в релевантни за заболяването геномни сайтове, включително локуси на безопасно вмъкване в геномни сайтове. Това ще може да се използва за имунотерапия на рак и гени, замесени в генетични заболявания със загуба на функция.
EvoCAST също така извършва целенасочена интеграция в множество типове човешки клетки, включително първични човешки фибробласти, и показва висока чистота на продукта, без открити вмъквания и заличавания (инсерции и делеции - индели), предимно еднопосочно вмъкване на ДНК с прецизност на интеграцията - една нуклеотидна двойка и ниски нива на интеграция извън целта.
Тази работа утвърждава CAST като мощна платформа за ефективна, РНК-насочвана генна интеграция в човешки клетки. Предимствата на evoCAST – включително неговата лесна програмируемост, механизъм за интегриране в една стъпка и избягване на прекъсвания на геномни двойни вериги – го правят много подходящ за много приложения в науките за живота и терапията, включително възможността за справяне с генетично различни пациенти чрез един и същ агент за редактиране. Системата CAST PACE, разработена в тази работа, също така предоставя стратегия за подобряване на свойствата на други естествено срещащи се CASTs към тяхното използване за ефективно редактиране на генома на човешки клетки.
„В тази работа ние открихме, че ключово затруднение за CAST в човешките клетки е неговата ограничена активност на транспозиране“, коментира водещият автор Уайт. „Сега, след като се справихме с това чрез лабораторна еволюция, CAST може да се отличи като инструмент за редактиране на генома в човешки клетки, до голяма степен поради произхода си като естествено съществуваща система за РНК-насочвана генна интеграция.“
В човешките клетки evoCAST успешно инсталира гени, подходящи при заболявания като анемия на Фанкони и фенилкетонурия, и за подобрена CAR-T клетъчна имунотерапия с ефективност между 10 и 20 процента. В момента екипът работи за по-нататъшно развитие на evoCAST за използване в терапевтично подходящи настройки и за прилагане на тяхната новосъздадена платформа CAST PACE към други CAST системи, открити в природата.
„Мобилните генетични елементи като CAST предлагат поглед към изобретателността на природата в програмируемата манипулация на генома“, отбелязва един от ръководителите на изследването Самюел Стърнберг (Samuel Sternberg). „С evoCAST показахме как лабораторната еволюция може да трансформира тези естествено възникващи системи в мощни инструменти за терапевтично вмъкване на гени – и вярваме, че сме съвсем в началото на това, което ще бъде възможно в бъдеще.“
Горе в ляво: CAST (свързана с CRISPR транспозаза) използват CRISPR-Cas система с дефицит на нуклеаза, за да включат транспозазен комплекс, който катализира ДНК интеграцията(integrated DNA) в близост до прицелно място в генома(target)(горе вляво). Горе вдясно: Чрез фагова еволюционна селекция на САST - PACE, селекция, се свързва целевото интегриране на компоненти на фагите((бактериални вируси) с размножаването на им в бактериите E. coli.Тези компоненти кодират транспозазни белтъци (в синьо). Долу вляво: Еволюцията на фаговите варианти създават еволюирал CAST. Това довежда до >200-кратно подобрена интеграция на ДНК в човешки клетки (долу вляво). Долу вдясно: EvoCAST подходът позволява ефективно и целенасочено интегриране на терапевтично значими гени (cDNA) в много геномни локуси (долу вдясно) и в различни видове човешки клетки. Така се , проправя пътя за мутационно-агностични терапии на генетични заболявания, при които има загуба на функция.
Ето и една по-подробна схема на метода:
Непрекъсната еволюция с помощта на фаги (PACE), свързана с CRISPR в комбинация с транспозази (CASTs). (A) Преглед на РНК-насочвани ДНК интеграции CAST от по тип I-F. Прицелването към специфична ДНК се осъществява от ефекторен комплекс Cascade от компоненти на генни редактори CRISPR - Cas6, Cas7, Cas8 и CRISPR РНК (crRNA), в комплекс с транспозонния протеин TniQ (наричани заедно - QCascade). Свързания с целевата ДНК QCascade привлича ензима AAA+ ATPase TnsC, който впоследствие набира хетеромерната TnsA-TnsB (А и В са белтъчни субединици) транспозаза за да катализира изрязването на транспозонната ДНК и интегриране на транспозона(т.е. парчето ДНК , което трябва да се вмъкне в прицелното място(целевия локус). (B) Схема на PACE метода за еволюцията на CAST. Селекционният фаг (SP) кодира еволюиращи CAST протеини. Гостоприемникът E. coli кодира селективен цикъл, който свързва CAST интеграцията с gIII експресията, която произвежда основния фагов протеин pIII. Производството на pIII позволява на фагите SP, кодиращи активни CAST протеини, да се размножават. PACE се провежда в съд с фиксиран обем („лагуна“) при постоянно разреждане с пресен гостоприемник E. coli, така че само фагите SP, разпространяващи се по-бързо от скоростта на разреждане, могат да оцелеят и да еволюира. (C) Съсрав на първоначалната цикъл на селекция чрез CAST PACE.Селекционния фаг SP кодира подлежащите на еволюция транспозазни протеини TnsA-TnsB [слепени един за друг) и TnsC, докато неподлежащите на еволюция белтъчни компоненти на CAST са кодирани на допълнителния плазмид (CP1). Интегрирането на транспозон е осигурено от втори комплементарен плазмид (CP2). Насочването р определено от crRNA, кодирана в спомагателния плазмид (АР). Така се инсталира промотор пред ДНК участъка носещ gIII, което води до експресия на gIII и размножаване на фага SP. Репликиращите се фаги SP натрупват мутации, предизвикани от мутагенезния плазмид (МР) (48), така че потомствените фаги SР кодират нови варианти на CAST протеините (TnsA-TnsB) , които се селектират в следващите поколения.
Удивителното е, че представеният нов подход използва инструменти, които съществуват в природата - CRISPR, CAST, скачащи гени (транспозони), плазмиди, стимулиращи мутациите, агресивни фаги и т.н. Тези “тайни на клетката” бяха разкрити в последните десетилетия. Преди повече от 50 години (1968) един от основателите на молекулярната биология у нас- д-р Георги Марков издаде популярната си книга (Тайните на клетката):
Тази книга оказа голяма влияние на няколко поколения бъдещи български биолози. Може да я сравним с влиянието на книгата на Шрьодингер - “What is life”
Изтеклият половин век показа, че резервоарът с “тайни” не пресъхва. Геният на природата съавторства с човешкия гений. Това води до ценни иновации в генната терапия.
Представи: Константин К. Чипев, PhD в Ню-Йоркския Щатски Университет в Стони Брук.
Справка: ‘Programmable gene insertion in human cells with a laboratory-evolved CRISPR-associated transposase’; Isaac P. Witte, George D. Lampe, Simon Eitzinger, Shannon M. Miller, Kiara N. Berríos, Amber N. McElroy, Rebeca T. King, Olivia G. Stringham, Diego R. Gelsinger, Phuc Leo H. Vo, Albert T. Chen, Jakub Tolar, Mark J. Osborn, Samuel H. Sternberg, David R. Liu; Science 15 May 2025 Vol 388, Issue 6748 DOI: 10.1126/science.adt5199
Коментари
Моля, регистрирайте се от TУК!
Ако вече имате регистрация, натиснете ТУК!
Няма коментари към тази новина !
Последни коментари
dolivo
Учени възпроизвеждат сияйното египетско синьо, озарявало гробниците на фараоните
dolivo
Революция в залесяването: Японски дронове с изкуствен интелект засаждат дръвчета 10 пъти по-бързо от хората
alabal
Най-старото живо същество на Земята: вид на 700 млн. години, който променя разбирането за еволюцията
dolivo
Математиката, биологията и психологията вещаят края на Западната цивилизация