Имена, които трябва да знаем – За хората и ваксините – част II

Прилагането на ваксините се очертава като единствената надежда да се справим с коварната коронавирусна пандемия, вече взела над 2 милиона жертви в световен мащаб.

Продължаваме да ви запознаваме с учени, допринесли много за разработването на ваксините, представени от Константин Чипев, молекулярен и клетъчен биолог от Университета Стони Брук в Ню Йорк.

След фундаменталното откритие на Карико и Вайсман в периода около 2005 г., което отваря пътя за използуване на информационната мРНК за генетични манипулации, малко учени осъзнават потенциала на този нов подход. Един от тях е Дерик Роси (Derrick Rossi). Но той не търси ваксини, а използува модифицираните РНК, за да произвежда плурипотентни стволови клетки като репрограмира диференцирани клетки с мРНК.

Опитът се оказва повече от успешен. Роси го споделя с колеги и така стига до Робърт Лангер от Масачузетския Технологически Институт. Лангер е не само професор по биомедицина там, но и известен изобретател (с повече от 400 патента) и с връзки сред потенциалните инвеститори. Така в 2010г. след срещата си с Роси Лангер осъзнава, че мРНК-ите ще имат много по-широко приложение за всякакъв вид генни терапии - за лекарства, ваксини и др., отвъд областта на стволовите клетки. След няколко дена Роси прави изложение и пред компанията Флагшип Венчърс в Кембридж, ръководена от ливанския арменец Нубар Афеян, който реагира ентусиазирано. След няколко месеца Роси, Лангер, Афеян и др. основават в Харвард преуспяващата днес фирма Moderna.

Роси съставя иметo й от комбинация на думите "MODification" и "RNA" (за РНК). Започва събиране на инвестиции и научни разработки. Карико и Вайсман също създават компания, която не просперира дълго. Moderna пък има патентен проблем с използуване на модифицираните РНК-елементи - 5-метил-цитидин и псевдо-урацил (по метода на Карико и Вайсман). Затова първата задача на учените във фирмата е да намерят друг аналог с подобно действие. Така се стига до 1-метил-псевдоуридин, а след това и много други модификации с много добри показатели.

Появяват се и други противоречия. Афеян и Лангер признават, че идеята на Роси (респ. на Карико и Вайсман) е пренасочена към нови ваксини и други лекарства използуващи кодиращите мРНК, и че самият Роси не е осъзнал тези възможни приложения. Появяват се разногласия по този въпрос. Роси твърди, че не е така, и че още докато им е представял метода е било ясно фармакологичното му приложение. Че това не е далеч от мисълта, говори и фактът, че по същото време в Германия Ур Шахин и съпругата му Йозлем Тюреджъ също работят в тази насока.

_{Дерик Роси – ко-основател на фармацевтичната компания Moderna. Кредит: Wikimedia Commons}

Скоро (2011г.) начело на Moderna застава харизматичният Стефан Банцел. Той успява да убеди партньори и инвеститори, че Moderna няма да е компания произвеждаща един продукт, а че има потенциял в бъдещето (понастоящем над 50 лекарствени разработки).

Ваксината срещу COVID-19, която вече се прилага по света, е разработена в сътрудничество на Moderna с групата на Барни Греъм, ръководител на Центъра по ваксинни изследвания към Националния Институт по Алергични и инфекциозни болести. Този институт, от своя страна, е под ръководството на прочутия д-р Антъни Фаучи, главен консултант в САЩ по пандемията през 2020). Главен изследовател в групата на Греъм е 35 годишната Кизмикия Корбет. Тя се включва през 2014г. и по думите на д-р Антъни Фаучи е водеща фигура в коронавирусния тим, разработващ ваксините. Той подчертава този факт, за да може да убеди скептичните към ваксинирането афроамериканци.

Кизмикия е от Северна Каролина, завършила е Мерилендския Университет. В практиката си изследва различни патогени и търси ваксини в лаборатории от Стони Брук до Шри Ланка. Получава докторска степен по имунология и микробиология от Университета в Чапел хил (Северна Каролина) през 2014г.

 _{Д-р Кизмикия Корбет (вляво) и д-р Барни Греъм (вдясно)}

^{Греъм и Корбет, пред президента Тръмп, Ентъни Фаучи и директорът на Националните Институти по Здравеопазване д-р Френсиз Колинз на посещение в лабораторията (2020г.)}

Началните изследвания на д-р Корбет са по изработване нa ваксини срещу коронавирусите на SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) и МERS (Middle East Respiratory Syndrome). Тя открива лесен начин за стабилизиране на конформацията (пространственото разположение) на изкуствено произведените вирусни шипове, така че да бъдат хем имуногенни, хем по-лесни за производство. Така тя и групата й са „в крачка“, и, когато в началото на 2020г. започва COVID-19 пандемията, те не само определят тримерната структура на този нов коронавирус, но и изработват ваксини срещу него.

В колаборация с Moderna започва манифактурното производство и клиничното тестване на ваксината и за по-малко от година тя се прилага. Кизмикия е много щастлива и кaзва:“ това, че живея в този момент, когато имам възможността да работя върху нещо от глобална належаща важност – е фантастично“. Тя се грижи да образова и агитира скептичната към ваксиниране афроамериканска популация (само 15% от тях вярват, че ваксината ще помогне). Така става по-лесно за тях да не се страхуват, че белият човек иска да ги трови с ваксиниране.

Показателна е скоростта, с която са извършени изследванията и конструирането на ваксината на Moderna:

- 10 януари 2020г. - публикуване на генетичната последователност на вирусната РНК .
- 13 януари 2020г. - Центърът по Вирусни Изследвания и Moderna решават коя да бъде последователността на мРНК, използувана за бъдещата ваксина. По тази мРНК в клетките ще се синтезира антигенът - вирусният шип, един белтък дълъг 1273 аминокиселини
- 2 февруари 2020г. – ин витро експресия на мРНК-1273
- 4 февруари 2020г.- ваксинирани са мишки и е приготвен клиничният продукт - ваксината на Moderna мRNA-1273
- 18 февруари 2020г. – демонстрирана е имуногенността на ваксината в мишка
- 19 февруари 2020г. - в списанието Сайънс е публикувана структурата на вирусния шип. (Кизмикия Корбет е водещият автор)
- 16 март 2020г. - начало на клинични изследвания фаза I
- 29 май 2020г. – начало на клинични изпитания фаза II
- 27 юли 2020г. - начало на клинични изпитания фаза III
- декември 2020 - официално одобрение за употреба на ваксината в САЩ и Европа и начало на ваксинациите в САЩ.

Забележително постижение! В резултат на усилията на много учени от много страни в продължение на много години. И начало на една нова ера и страница в генната терапия!

При изработването на ваксините срещу коронавирусите се използуват редица „трикове“. Структурата на вирусния шип на COVID-19 представлява три еднакви белтъка обвили се като тример в отворена конформация преди сливането (перфузията) на вируса в клетките. Трудно е да се изредят всички герои в епичната борба срещу вирусната пандемия. Тя не е започнала миналата година, а както се вижда, преди повече от десет години.

Ниеншуан Уан (Nianshuang Wang) (вдясно) работи в лабораторията на д-р Джейсън МакЛeлан (вляво) заедно с Даниел Урап (в средата) в Тексаския Университет, гр. Остин. В 2016 г. те намират начин да стабилизират лабилната пространствена структура на един коронавирусен шип, но цяла година им е трудно да публикуват резултата. Днес техният подход е в основата на конструрането на Ковид ваксините на Moderna и Пфайзер/Бионтех и др.

Уан е син на фермер от Източната провинция на Китай Шандонг. Има интереси към биологията и завършва университет и докторат в Китай. Когато десет години след корона вируса SARS в 2012г. се появява вторият патогенния коронавирус MERS-CoV той се включва в изследването му. За 40 дни определя структурата на вирусния шип S, свързана с рецептора и показва как вирусът използува този „ключ“ S за да „отключи“ човешките клетки.

През 2014 г. Ниеншуан Уан продължава научната си кариера в САЩ в лабораторията на проф. МакЛeлан. Д-р МакЛeлан си сътрудничи с д-р Барни Греъм от Центъра за Вирусни Изпитания, където вече е и Кизмикия Корбет, връстница на Уан. Там се работи върху ваксина срещу коронавирусите на SARS и MERS. Проектът за стабилизиране на вирусния шип е даден на Ниеншуан. Той е упорит и продуктивен учен. Минават месеци в безплодни опити. Изпробва около стотина мутации на аминокиселините на вирусния шип, които да заздравят структурата му в активната й перфузионна форма преди сливане с клетъчната мембрана. Намира две подходящи замени, които могат да се прилагат за всякакви коронавируси.

Когато публикуват резултата, вече е 2017 г. и вирусът на MERS вече на практика е изчезнал. Ниеншуан Уан е донякъде разочарован. Но когато започва пандемията на COVID-19, лабораториите на МакЛелан и Греъм знаят как да процедират. Трикът е да се заменят с пролини две съседни аминокиселини (лизин и валин) между две алфа-спирали - хептадния повтор HR1 и централната спирала CH (Фиг.1). Подобно на твърда метална скоба двата пролина фиксират разположението на спиралите и пречат на удължената спирална структура, която шипът заема в клетъчната мембрана след сливането (перфузията) (вж. Фиг.1 долу вляво).

Фиг.1 Главни части на коронавируса - кандидати за ваксина
_{Корона вирусът COVID-19 или (SARS-CoV-2) се състои от четири основни структурни белтъци:Шип (S), мембрана (M), обвивка (E), които оформят повърхността на вириона, и нуклеокапсид (N), който свързва вирусната РНК във вириона. S белтъкът е показан като тример в пре-фузионна конформация. Всеки монономер се състои от две субединици: S1 (включваща N-край (NTD) и област на свързване с клетъчния рецептор (RBD), рецепторния мотив (RBM) в RBD е също означен; и субединица S2 - с пептид (FP), свързваща област (CR), хептаден повтор 1 (HR1), и 2 (HR2) и централна спирала (CH). Шипът SARS-CoV-2 S се свързва с атакуваната клетка чрез нейния рецептор, димерния ангиотензин-конвертиращ ензим 2 (hACE2), чрез RBD участъка. Скъсването между S1–S2 от конвертазата фурин и на мястото S2′ от протеазат, необходимо за сливане на вирусната и клетъчната мембрана. Показан е S2-тримера на вирусния шип в пост-фузионно разположение (опъната форма - долу вдясно на фигурата). Предната част на шипа – S1, участъкът RBD е удобна цел за ваксина. Когато RBD е приготвен под формата на димер или тример имуногенността на ваксината е по-голяма. Префузионният шип S не е стабилен и лесно преминава в пост-фузионна конформация. Замяната (мутация) на две аминокиселини лизин и валин (K986 и V987) с пролини (P) стабилизира шипа (S-2P) (долу вляво на фигурата) и предотвратява прехода от пре-фузионно в пост-фузионно състояние. Образуването на тримери се предизвиква с включване на три специални „лепенки“ - тримеризиращи участъците в С-краищата на двете субединици S1 и S2. *(вж. още подробности в текста).}

Вирусният шип S на COVID-19 e съставен от 1273 аминокиселини, от там и обозначението на ваксината на Moderna - mRNA-1273. От тях участък, дълъг 193 аминокиселини, образува структурата RBD, свързваща се с рецепторите на подлежащите на инфектиране клетки. Ваксината на Moderna mRNA-1273 използува целия белтък S на шипа, докато тази на Пфайзер/Бионтех, която в момента се прилага – BNT162b1 - кодира само областта RBD (Пфайзер имат и друга ваксина - BNT162b2 подобна на mRNA-1273). И двете ваксини произвеждат антигените в пространствена опаковка на тример (три еднакви белтъчни мономера), защото съдържат три „лепенки“– фолдони - специална област от 30 аминокиселини в С-края на Т4-бактериофаговия фибритин, имаща способност да засукват белтъчните вериги на три мономера. Това увеличава имуногенността на ваксините. В една от изработваните в Китай ваксини към белтъка S са добавени пък фолдони от C-крайната област на колаген тип Iα, които също опаковат антигена S като хомотример. 

Антигенът S, т.е. целият вирусен шип, се използува за ваксините на АстраЗенека(Оксфорд, Великобритания), Спутник V (Изследователски Институт „Гамалея“, Русия), и за ваксини в Китай, Южна Корея и другаде.

В края на 2020г. в Лондон се появи нов по-заразен корона-вирусен щам. Той има мутация в C-края на областта (RBD) за свързване на шипа с рецептора. В позиция 501 аспарагинът (N) e заменен с тирозин (Y) (това се означава с S:N501Y), както и мутации в други области на шипа. S:N501Y явно променя връзването с рецептора АСЕ2 и увеличава силата на инфекция. Такива мутации стават непрестанно при размножаването на вирусите. Особено на тези, носещи РНК. При тях стават 10‑6 до 10-4 мутации на нуклеотид на клетка при всяка клетъчна инфеkция. Ако шипът е 3000 нуклеотида дълъг, може да се очаква една до сто мутации при инфектиране на 300 клетки. Но някои кодони няма да се променят, а и не всички мутирали аминокиселини ще са важни за структурата. Освен това, ако мутацията прави вируса по-некадърен, той няма да се размножава (пропагира).

Както разказахме, бързото внедряване на ваксините за COVID-19 се дължи на пълната готовност на учените в началото на пандемията. Належащата необходимост от ваксина ускори формалното одобряване на ваксините на Moderna и Пфайзер/Бионтех в САЩ и Европа. Така се стигна до масово прилагане за първи път на мРНК-ваксини. Това е една по същество генна терапия, пред която се отварят широки хоризонти за приложение в борбата с всякакви вирусни и други заболявания.

Трудно е да се изредят всички герои в епичната борба срещу вирусните пандемии. Тя не е започнала миналата година, а както се вижда, преди повече от десет години. Цяла армия учени от различни части на света участвуват и в изработването на ваксините. Тук сме избрали само няколко от водещите имена."

***
Преразказ от Константин К. Чипев по материали от световния научен печат
и Dai, L., Gao, G.F. Viral targets for vaccines against COVID-19. Nat Rev Immunol (2020). https://www.nature.com/articles/s41577-020-00480-0
Три-минутен клип за разработването на ваксината: https://www.youtube.com/watch?v=7wMa06xhgWg&ab_channel=utexasCNS

Още по темата

30/12/2020

Животът

Как действат различните ваксини

23/12/2020

Животът

Какви са разликите между ваксината на Moderna срещу COVID-19 и тази на Pfizer?

18/12/2020

Медицина

Имена които трябва да знаем: Лидери с приноси в изработването на ваксината

05/12/2020

Животът

Как работят ваксините срещу SARS-CoV-2 и кои са техните създатели